ІФА тест система для діагностики АТ до вірусу лейкозу ВРХ, 10 плашок, 960 реакцій, 12.BLV.K.3/10, 10 планшетів

ІФА тест система для діагностики АТ до вірусу лейкозу великої рогатої худоби, 10 плашок, 960 реакцій

Набір ІФА (блокуючий варіант) для визначення антитіл специфічних до вірусу лейкозу ВРХ в сироватці крові корів або молоці

Діагностичний набір базується на методі блокуючого ІФА, заснованого на використанні двох МаТ до вірусного глікопротеїну gp51. Тест-система дозволяє визначати антитіла до вірусу лейкозу ВРХ в сироватці крові і молоці ВРХ.

Суть методу:

Полістиролові планшети покриті gp51, які адсорбовані на планшеті за допомогою 2х специфічних антитіл до вірусного протеїну gp51. Після додавання зразка в лунку, якщо в ньому містяться специфічні антитіла до вірусу, вони прикріпляться до антигену. Якщо ми додамо специфічне МаТ до вірусного антигену, який знаходиться на планшетах (кон'югтроване пероксидазою), то воно вступить в реакцію з антитілами в сироватці. Якщо сироватка містить специфічні антитіла, вони не допустять прикріплення маркованих МаТ до антигену. Після промивання, щоб змити всі не закріплені матеріали, можна визначити присутність/ відсутність маркованих МаТ, за допомогою додавання субстрату ТМВ, в разі присутності пероксидази відбувається колориметрична реакція, яку можна виміряти за допомогою спектрофотометра.

 

Склад набору

Компоненти	Кількість
96 лункові мікропланшети розділені на 12 стрипів по 8 лунок	10
Флакони з Позитивною контрольною сироваткою (Positive Control)	2 х 1,5 мл
Флакони з Негативною контрольною сироваткою (Negative Control)	2 х 1,5 мл
Кон'югат пероксидази 100х концентрований (peroxidasa conjugate)	2 x 700 μl
Концентрат для промивання (25х)	125 мл
Розчинник сироватки (DE04-01) готовий до використання	2 х 125 мл
Субстрат розчин (ТМВ) готовий до використання	125 мл
Зупиняючий розчин	125 мл

Необхідні матеріали, які не входять до складу набору

• Дистильована вода.
• Мікропіпетки від 5 до 200 μl.
• Одноразові наконечники для піпеток.
• Пристрій для промивання планшет.
• Пробірки 50-250 мл.
• Рідер ІФА 450 нм.

 

Запобіжні заходи:

1. Уважно прочитайте інструкцію.
2. Всі реагенти повинні бути нагріті до кімнатної температури (20-250ºС).
3. Не змішуйте інструкції, а також реактиви з різних наборів.
4. Уникайте забруднення реагентів набору.
5. Не використовуйте реагенти з різними номерами партій, а також реагенти з різних наборів.
6. У приміщенні не їжте, не паліть і не пийте.
7. Не піпетувати ротом.
8. Використовуйте новий наконечник для кожного зразка сироватки.
9. Субстрат розчин і субстрат буфер слід використовувати з обережністю.
10. При використанні набору кожен раз використовуйте новий розчин субстрату.
11. При використанні набору, позитив і негатив контрольні сироватки повинні бути використані систематично.

Зберігання реактивів

Зберігати всі реактиви при температурі +4ºC.

Зупиняючий розчин може мати осад, якщо це сталося, нагрійте розчин до 37ºC перед використанням.

Промивання

Промивання може здійснюватися за допомогою автоматичного промивача або багатоканальної піпетки, яка може розподілити 300 μl рідини в кожну лунку.

Після інкубації, промивання слід здійснювати, дотримуючись наступного:

• Вилити вміст планшета різким рухом, щоб уникнути попадання рідини з однієї лунки в іншу.
• Розподілити 300 μl рідини в кожну лунку.
• Акуратно потрясти планшет, уникаю контакту вмісту лунок між собою.
• Різким рухом спустошити планшет.
• Повторювати промивання стільки раз, скільки вказано в інструкції до набору.
• Перш ніж вилити вміст лунок в останній раз переконайтеся, що наступний реагент, який ви будете додавати готовий до використання.
• Після останнього промивання планшет обернути папером для усунення зайвої рідини.

Підготовка зразків

Для дослідження використовується сироватка крові або молоко ВРХ як індивідуальні, так і пулові зразки (10 зразків сироватки). Якщо використовуються зразки молока, то з них рекомендується зняти піну.

Підготовка реагентів

• Розчин для промивання

Розбавити одну частину концентрованого розчину для промивання, який входить в набір, 24 частинами дистильованої води (40 мл концентрованого розчину і 960 мл води). Розчин залишається стабільним при температурі +4ºC.

• Контрольна сироватка

Контрольну сироватку необхідно розводити так само як і зразки, додаючи по 50 μl контролів в кожну лунку + 50 μl розчинника. Після відкриття вони стабільні протягом місяця при +4ºC, для довгого зберігання рекомендується зробити аліквоти і зберігати при -20ºC.

• Підготовка кон'югату: безпосередньо перед використанням

Розведіть необхідну кількість кон'югату, який входить в набір з розчинником, в пропорції 1/100. Наприклад, 110 μl кон'югату в 11 мл розчинника для кон'югату, цієї кількості буде достатньо для 1 планшету 96 лунок. 10 μl кон'югату в 1 мл розчинника для кон'югату, цієї кількості буде достатньо для 1 стрипа.

 

Процедура постановки дослідження

1. Всі реактиви необхідно витримати при кімнатній температурі перед дослідженням (крім кон'югату).
2. Додайте 50 μl розчинника в усі лунки планшета. Додайте по 50 μl позитив контролю, негатив контролю і зразка в решту лунок. При такій схемі ви будете проводити дослідження в розведенні ½. Струсіть планшет. Контрольні сироватки рекомендується дублювати. Закрийте клейкою плівкою та інкубуйте 1 годину при 37ºС (± 3ºС).
3. Промийте кожен планшет 3 рази, дотримуючись процедури промивання.
4. Додайте 100 μl кон'югату, підготовленого як описано вище, в кожну лунку. Заклейте плівкою і Інкубуйте 30 хвилин при 37ºС.
5. Промийте кожен планшет 4 рази, дотримуючись процедури промивання.
6. Додайте 100 μl розчину субстрату, підготовленого як описано вище, в кожну лунку. Залиште при кімнатній температурі на 10 хвилин в темному місці.
7. Додайте 100 μl зупиняючого розчину в кожну лунку, в такому ж порядку як ви додавали субтсрат.
8. Порахуйте ОП при 450 нм.

 

Читання та інтерпретація результатів

Тест вважається достовірним якщо ОП НК вище ОП ПК більше, ніж в 5 разів

• ОП НК / ОП ПК > 5.
• ОП НК вище, ніж 1.

Інтерпретація

• Cut off негативний = НК - [(НК-ПК) х 0,4].
• Cut off позитивний = НК - [(НК-ПК) х 0,5].

Для скринінгу:

• Зразки, у яких оптична щільність нижче, ніж значення позитивного cut off, вважаються позитивними до вірусу лейкозу.
• Зразки, у яких оптична щільність вище, ніж значення негативного cut off, вважаються негативними до вірусу лейкозу.
• Зразки, у яких оптична щільність між значеннями cut off, вважаються сумнівними. Рекомендується повторити дослідження через 3 тижні.

 

Наприклад:

НК (-)	1,750
ПК (+)	0,154
Зразок 1	0,170
Зразок 2	1,684

Валідація

НК / ПК = 11,3 > 5

НК = 1,750 > 1

Cut off негатив = 1,750 - [(1,750-0,154) х 0,4] = 1,111

Cut off позитив = 1,750 - [(1,750-0,154) х 0,5] = 0,952

Зразок 1 = позитивний до вірусу лейкозу ВРХ.

Зразок 2 = негативний до вірусу лейкозу ВРХ.